V auguste minulého roka laboratórium vo Wu-chane vyvinulo test PCR na zistenie vírusu opičích kiahní, ktorý bol zverejnený vo februári tohto roku, mesiace predtým, ako sa objavil prvý oficiálny prípad.
Neziskový sektor: SLSP Názov účtu: Dôstojnosť Slovenska SK28 0900 0000 0051 7971 8989 Ďakujeme
Všetky práva vyhradené ® OZ Dôstojnosť Slovenska. Zákaz kopírovania!! Zdieľanie dovolené.
Hneď na to WHA (WHO) koncom novembra 2021 zvolalo (tajné) zhromaždenie a následne EÚ (EMA) schválila liek proti kiahňam už v januári 2022 – ale účinok a bezpečnosť nejasné!
Fakt, že americká vláda objednala milióny dávok jedinej schválenej vakcíny proti pravým kiahňam po tom, čo sa v USA stal známy jediný prípad opičích kiahní, prinútil zamyslieť sa – najmä preto, že nemenovaná krajina EÚ si vakcínu okamžite objednala od spoločnosti Bavaria Nordic, ktorú skladovali. Dobré peniaze sa však dajú zarobiť aj na liekoch v prípade ďalšej „pandémie“: Antivírusový liek proti kiahňam získal schválenie EÚ v januári 2022. Podľa agentúry EMA sa bezpečnosť a účinnosť vakcíny aj lieku sotva bolo preukázané.
Ide o liek Tecovirimat . Môže sa použiť na liečbu infekcií kiahní, opíc a kravských kiahní u dospelých a detí s hmotnosťou nad 13 kg. Je schválený aj na liečbu komplikácií po očkovaní proti živým kiahňam, ak sa vírus z vakcíny replikuje. Podľa EMA bol schválený 6. januára tohto roku. RKI uvádza tecovirimat ako jedinú možnosť terapie proti opičím kiahňam.
Pharmazeutische Zeitung komentoval schválenie v januári takto:
Hoci pravé kiahne boli v skutočnosti od konca 70. rokov 20. storočia eradikované, v laboratóriách naďalej existujú. Tecovirimat bol vyvinutý na ochranu pred biologickými útokmi . Teraz to schválila Európska komisia.
Takto sme informovali 18.5.2022 o simulačnej hre na vírus opičích kiahní, ktorá „predpovedala“ teroristicky motivované uvoľnenie vírusu práve v máji 2022: „
Iba schválená vakcína: Imvanex
Vakcína proti pravým kiahňam Imvanex od spoločnosti Bavaria Nordic, ktorá je schválená v EÚ od roku 2013 (a v USA od roku 2019 ), je živá vakcína, ale údajne je založená na geneticky modifikovanom víruse pravých kiahní (modifikovaný vírus vakcínie Ankara, MVA), že ani nespôsobuje, ani nespôsobuje choroby, by sa v ľudskom tele nemalo vedieť množiť. V prípade opičích kiahní by sa v Európe mohol používať mimo označenia. V roku 2019 FDA citovala Petra Marksa, riaditeľa Centra pre biologické hodnotenie a výskum FDA, v priebehu schvaľovania vakcíny:
V roku 1980, po globálnom programe na eradikáciu kiahní, Svetová zdravotnícka organizácia potvrdila eradikáciu prirodzene sa vyskytujúceho ochorenia kiahní. Rutinné očkovanie americkej verejnosti bolo zastavené v roku 1972 po eradikácii choroby v USA av dôsledku toho veľká časť americkej a svetovej populácie nemá imunitu. Hoci prirodzene sa vyskytujúce kiahne už nie sú globálnou hrozbou, zámerné uvoľnenie tohto vysoko nákazlivého vírusu by mohlo mať ničivé účinky. Dnešné schválenie odráža záväzok vlády USA byť pripravený podporou vývoja bezpečných a účinných vakcín, terapeutík a iných lekárskych protiopatrení.
Oba prípravky sú experimentálne: chýbajú údaje o účinnosti a bezpečnosti!
Podľa FDA bola bezpečnosť vakcíny testovaná len na 7800 subjektoch. Najčastejšie hlásené vedľajšie účinky boli bolesť, začervenanie, opuch, svrbenie, citlivosť v mieste vpichu, bolesť svalov, bolesť hlavy a únava. Úrad neopísal žiadne konkrétne obavy o bezpečnosť.
Agentúra EMA zase na svojej webovej stránke výslovne upozorňuje, že liek Tecovirimat aj vakcína Imvanex boli schválené za „výnimočných okolností“. To znamená:
Druh povolenia na uvedenie na trh pre lieky , pri ktorom žiadateľ nie je schopný poskytnúť komplexné údaje o účinnosti a bezpečnosti za normálnych podmienok používania, pretože liečený stav je zriedkavý alebo je nepraktické či neetické zbierať úplné informácie.
S Tecovirimat si môžete prečítať:
Keďže liek Tecovirimat SIGA bol povolený za výnimočných okolností, spoločnosť, ktorá liek Tecovirimat SIGA uvádza na trh, poskytne údaje o účinnosti a bezpečnosti lieku u pacientov užívajúcich liek v prípade prepuknutia kiahní.
https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/tecovirimat-siga
A v spoločnosti Imvanex:
Imvanex bol povolený za „mimoriadnych okolností“. Je to preto, že kvôli zriedkavosti ochorenia nebolo možné získať úplné informácie o lieku Imvanex. […]
https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/imvanex
Keďže Imvanex bol povolený za výnimočných okolností, spoločnosť, ktorá Imvanex uvádza na trh, poskytne údaje o prínosoch a rizikách očkovacej látky z pozorovacích štúdií u pacientov, ktorým bola očkovacia látka podávaná, a o tom, či niekedy v budúcnosti dôjde k prepuknutiu choroby. príchod, nasadenie.
Takže ten, kto dostane tieto prípravky, je opäť pokusný králik.
Opičie kiahne dali dokopy v neslávne známom laboratóriu Wuhan
Virologický inštitút vo Wu-chane nielenže usilovne skúmal koronavírusy predtým, ako boli vypustené na ľudstvo – akýmikoľvek prostriedkami. Ďalšie experimenty sa zaoberali aj opičími kiahňami, ktoré armáda dlho vnímala ako potenciálnu vojnovú zbraň. Vo februári 2022 ústav zverejnil štúdiu o detekcii genómu vírusu pomocou testu PCR z vírusov opičích kiahní špeciálne zostavených na tento účel. Ale? Začali to skúmať ešte v minulom roku!!
V Anglickom jazyku: TU klikni na stiahnutie PDF v anglickom jazyku
V Slovenskom jazyku tu dole:
V štúdii „ Efektívne zostavenie veľkého fragmentu genómu vírusu opičích kiahní ako qPCR templátu pomocou rekombinácie spojenej s transformáciou založenou na duálnom výbere (1)
“, wuhanské laboratórium zverejnilo genómové sekvencie vírusu opičích kiahní, ktoré umožňujú „rýchlu identifikáciu“ pomocou testov PCR. Vedecká skratka pre opičie kiahne je „MPXV“.
Pretože infekcia MPXV nebola nikdy spojená s prepuknutím v Číne, vírusový genómový materiál potrebný na detekciu qPCR nie je k dispozícii. V tejto správe sme použili duálne selektívny TAR na zostavenie 55 kb fragmentu genómu MPXV zahŕňajúce E9L a C3L, dva cenné ciele qPCR na detekciu MPXV alebo iných ortopoxvírusov.
Zo štúdie virologického inštitútu Wuhan
Metóda, ktorú vedci použili na svoju analýzu, by teoreticky tiež dokázala produkovať kompletné, reprodukovateľné vírusy. Rozhodli sa však pre dĺžku genómu v oblasti tretiny celého vírusu, aby sa vyhli rizikám. Toto by nebolo reprodukčné. To by bolo potešujúce, že Wuhanský virologický inštitút tiež robí výskum nebezpečných netopierích vírusov bez toho, aby mal riadne bezpečnostné protokoly .
V skutočnosti sa táto metóda v praxi používa na „vytváranie nákazlivých patogénov“. Existujú kmene vírusu opičích kiahní, ktoré sú "patogénnejšie a bolo hlásené, že infikujú ľudí v rôznych častiach sveta."
Hlavným účelom zostavenia fragmentu genómu MPXV je poskytnúť nukleotidový templát na detekciu MPXV.
Zo štúdie virologického inštitútu Wuhan
Bol potrebný výskum? Genom vydaný Izraelom v plnom rozsahu v roku 2018
Ak začnete hľadať, rýchlo nájdete, čo hľadáte: Kompletný genóm opičích kiahní publikovali izraelskí vedci v roku 2018 a nájdete ho tu: Diag nosis of Imported Monkeypox, Izrael, 2018 . Treba si preto položiť otázku, prečo sa s vírusmi opičích kiahní zrejme musí manipulovať v mnohých iných laboratóriách na celom svete, ak sú také nebezpečné, ako sa tvrdí.
28. februára 2022 Efektívne zostavenie veľkého fragmentu genómu vírusu opičích kiahní ako qPCR templátu pomocou rekombinácie spojenej s transformáciou založenou na duálnom výbere
Zvýraznenie
- •
-
Prvý montážny systém TAR využívajúci markery s dvojitým výberom.
- •
-
Vysoko účinný montážny systém TAR s nulovou mierou vektorovej recirkularizácie.
- •
-
Zostavenie genómového fragmentu MPXV obsahujúceho viacero cieľov detekcie qPCR.
Abstraktné
Na zostavenie veľkých konštruktov DNA sa široko používa rekombinácia spojená s transformáciou (TAR). Jednou z významných prekážok, ktoré bránia účinnosti zostavovania, je prítomnosť dráh opravy DNA náchylných na chyby v kvasinkách, čo vedie k recirkularizácii vektora alebo k nelegitímnym produktom rekombinácie. Na zvýšenie účinnosti zostavy TAR sme pripravili duálne selektívny vektor TAR, pGFCS, pridaním kazety PADH1 -URA3 do predtým opísaného kyvadlového vektora kvasinkových baktérií , pGF, nesúceho PHIS3 .–HIS3 kazeta ako marker pozitívnej selekcie. Táto nová kazeta funguje ako negatívny selekčný marker, aby sa zabezpečilo, že kvasinky nesúce recirkularizovaný vektor sa nemôžu množiť v prítomnosti kyseliny 5-fluórorotovej. Aby sa zabránilo rekombinácii pGFCS nesúceho ura3 s endogénnym ura3-52 v kvasinkovom genóme, pripravil sa vysoko transformovateľný kmeň Saccharomyces cerevisiae , VL6-48B, chromozomálnou substitúciou ura3-52 s transgénom prepožičiavajúcim rezistenciu na blasticidín. 55-kb genómový fragment vírusu opičích kiahnízahŕňajúci primárne detekčné ciele pre kvantitatívnu PCR sa zostavil pomocou TAR s použitím pGFCS vo VL6-48B. Zostavenie TAR sprostredkované pGFCS ukázalo nulovú mieru recirkularizácie vektora a priemerný správny výťažok zostavy 79 %, čo naznačuje, že stratégia dvojitého výberu poskytuje účinný prístup k optimalizácii zostavy TAR.
Kľúčové slová
1 . Úvod
Jednou z charakteristických čŕt kvasiniek je, že exogénne fragmenty DNA môžu byť účinne vychytávané a rekombinované. Typicky sa dva linearizované fragmenty DNA so 60 pármi báz (bp) prekrývajúcich sa sekvencií môžu ľahko rekombinovať a ligovať homológnou rekombináciou (HR) v kvasinkách ( Noskov et al., 2001 ). Na základe tohto znaku bola vyvinutá rekombinácia spojená s transformáciou (TAR). TAR preukázal veľkú hodnotu pri izolácii chromozomálnych fragmentov z genómovej DNA (klonovanie TAR), ako aj pri zostavovaní viacerých fragmentov DNA (zostavenie TAR) do jedného kvasinkového alebo bakteriálneho umelého chromozómu (YAC alebo BAC) [prehľad v ( Kouprina a Larionov 2016)]. Základným prístupom TAR je použitie linearizovaného vektora na zachytenie požadovanej DNA pomocou „háčikových“ sekvencií prostredníctvom HR po ich spoločnej transformácii do kvasinkových buniek . Účinnosť TAR však môže byť vážne obmedzená dráhami opravy DNA náchylnými na chyby , vrátane, ale nie výlučne, nehomologického spájania koncov (NHEJ) alebo spájania koncov sprostredkovaných mikrohomológiou (MMEJ) [prehľad v ( Lewis a Resnick, 2000 )] . Odhadovalo sa, že najmenej 10 % – 80 % kvasinkových transformantov obsahuje falošné produkty TAR a značná časť sa pripisuje recirkularizácii vektora ( Kuijpers et al., 2013 ).
Aby sa zvýšila účinnosť klonovania TAR, Vladimir a Natalay et al. navrhli systém duálneho výberu ( Noskov et al., 2003 ). Okrem autonómne sa replikujúcej sekvencie (ARS), ktorá podporuje replikáciu plazmidov v kvasinkách, boli do vektora TAR zavedené dva auxotrofné selekčné markery. Expresná kazeta HIS3 slúži ako pozitívny selekčný marker, aby sa zabezpečilo, že rekombinanty prežijú v syntetickom definovanom médiu bez histidínu ( SD/-His). „Háčikové“ sekvencie sú vložené medzi ADH1 promótor ( PADH1 ) a URA3 kódujúcu sekvenciu. Medzipriestor medzi P ADH1 a URA3 môže tolerovať inzerciu DNA s dĺžkou až 130 bp (Furter-Graves a Hall, 1990 ; Miret a kol., 1998 ), poskytujúci dostatok priestoru pre dva 60-bp „háčiky“ na zachytenie DNA. Keď sa linearizovaný vektor TAR recirkularizuje cez NHEJ alebo MMEJ, URA3 sa priamo pripojí k P ADH1 bez vloženia. P ADH1 -kontrolovaná expresia URA3 teda konvertuje kyselinu 5-fluórorotovú (5-FOA) v kultivačnom médiu na toxický produkt 5-fluóruracil a zabíja kvasinky nesúce recirkularizovaný vektor TAR. Na rozdiel od toho, ak TAR vektor zachytáva DNA pomocou svojho háku cez HR, potom inzercia medzi PADH1 a URA3 je väčšia ako 130 bp a expresia URA3 je zrušená. Výsledné kvasinky nesúce legitímne produkty rekombinácie sa môžu množiť v prítomnosti 5-FOA. Preto PADH1 -URA3 slúži ako negatívny selekčný marker na zrušenie recirkularizácie vektora. V prípade klonovania TAR by systém dvojitej selektívnosti mohol viesť k viac ako desaťnásobnému zvýšeniu počtu legitímnych klonovacích produktov ( Noskov et al., 2003 ).
Hoci sa systém dvojitej selekcie ukázal ako výhodný pre klonovanie TAR, nikdy sa nepoužil na zostavenie TAR. Na zostavenie veľkých mikrobiálnych genómov sa úspešne použil skôr opísaný kyvadlový vektor kvasiniek a baktérií pGF, ktorý obsahuje kazetu PHIS3 – HIS3 ako pozitívny selekčný marker ( Hou et al., 2016 ; Shang et al., 2017 ). V tejto štúdii sme pridali kazetu P ADH1 -URA3 k pGF ako negatívny selekčný marker a skúmali sme, či je možné použiť systém dvojitej selekcie pri zostavovaní TAR.
Opičie poxvírusy (MPXV) sú veľké DNA vírusy s uvádzanými veľkosťami genómu v rozsahu od 190 083 do 206 372 bp. Ako člen rodu Orthopoxvirus z čeľade Poxviridae sa MPXV delí na klady západnej Afriky a Konga. Ten je viac patogénny a uvádza sa, že infikuje ľudí v rôznych častiach sveta [prehľad v ( Brown and Leggat, 2016 )]. Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia (qPCR) je zlatým štandardom na detekciu ortopoxvírusu (vrátane MPXV). Na detekciu pan-ortopoxvírusov sa gén E9L (DNA polymeráza) ukázal ako vynikajúci cieľ pre testy qPCR ( Kulesh et al., 2004). Pre detekciu MPXV Li et al. uviedli, že gén C3L (proteín viažuci komplement) by sa mohol použiť ako cieľ qPCR pre kmeň MPXV z povodia Konga ( Li et al., 2010 ). Keďže infekcia MPXV nebola nikdy spojená s prepuknutím v Číne, vírusový genómový materiál potrebný na detekciu qPCR nie je k dispozícii. V tejto správe sme použili duálne selektívny TAR na zostavenie 55-kb genómového fragmentu MPXV, ktorý zahŕňa E9L a C3L , dva cenné ciele qPCR na detekciu MPXV alebo iných ortopoxvírusov. Duálne selektívne zostavenie TAR ukázalo nulovú mieru recirkularizácie vektora a priemerný legitímny výťažok zostavy 79 %, čo dokazuje, že P ADH1-URA3, ktorý slúži ako negatívny selektívny marker, môže optimalizovať zostavenie TAR zrušením recirkularizácie vektora.
2 . materiál a metódy
2.1 . Mikrobiálne kmene a informácie o plazmide
Saccharomyces cerevisiae kmeň VL6-48 (MATa, his3-delta200, trpl-delta1, ura3-52, ade2-101, lys2, psi+cir°) (Larionov et al., 1994), ktorý sa vo veľkej miere využíva pri klonovaní TAR a montáž, bol vybraný na genetickú modifikáciu . Kmeň Escherichia coliEPI300 (Lucigen), ktorý podporuje amplifikáciu vysokého počtu kópií plazmidov nesúcichoriV z plazmidu RK2 (Wild a Szybalski, 2004), bol vybraný ako bakteriálny hostiteľ na amplifikáciu YAC/BAC. Kyvadlo -bakteriálny kyvadlový vektor pGF nesúcioriVa expresnú kazetu PHIS3 – HIS3bol už skôr opísaný ( Hou et al., 2016 ).
2.2 . Transformácia kvasiniek a narušenie génov
Na narušenie ura3-52 v genóme VL6-48 sa gén blasticidín S deaminázy (BSD) (dĺžka 514 bp) amplifikoval polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s párom primérov URA3-BSD-S/A ( doplnková tabuľka S1 ). Upstream a downstream oblasti ura3-52 boli začlenené do PCR produktu na 5'- a 3'-konci ( obr. 1A), v tomto poradí, slúžiace ako homológne ramená pre chromozomálnu substitúciu ura3-52 s bsd pomocou HR . Produkt PCR sa transformoval do VL6-48 pomocou systému Gene Pulser Xcell Electroporation System (Bio-Rad) podľa predtým publikovaného protokolu (DiCarlo a kol., 2013 ). Po transformácii sa kvasinkové bunky naniesli na agarovú platňu YPD obsahujúcu blasticidín (300 μg / ml) a inkubovali sa pri 30 ° C počas 48 až 72 hodín, kým sa neobjavili kolónie. Genomický obsah transformovaných kvasiniek bol extrahovaný a podrobený genotypizácii. Priméry na genotypizáciu (BSD-S/Ter, doplnková tabuľka S1 ) boli umiestnené na štartovacom kodóne a 184 bp po smere od stop kodónu ura3-52 ( obr. 1 A). Kvasinkový kmeň s ura3-52 nahradeným bsd bol označený VL6-48B. Informácie o sekvencii všetkých primérov a sond použitých v tejto štúdii sú uvedené vDoplnková tabuľka S1 .
- Stiahnuť : Stiahnite si obrázok vo vysokom rozlíšení (1 MB)
- Stiahnuť : Stiahnite si obrázok v plnej veľkosti
Obr . Vývoj ura3-52 -defektného kmeňa VL6-48B. A Diagram lokusu ura3-52 vo VL6-48 a párov primérov na amplifikáciu génu bsd (URA3-BSD-S/A), genotypizáciu (BSD-S/URA3-Ter) a sekvenovanie (URA3-Pro) transgén. PCR amplikón bsd obsahuje 58- a 57-bp homológne sekvencie obklopujúce ura3-52 otvorený čítací rámec (ORF) na jeho 5'- a 3'-koncoch. Priméry na genotypizáciu cielili na štartovací kodón a 184 bp po smere od ura3-52 ORF. B Genomický obsah transformovaných kvasiniek bol extrahovaný a slúžil ako templát pre genotypizáciu PCR. Amplikón sa potom podrobil gélovej elektroforéze a pomocou farbenia etídiumbromidom sa pozoroval pás s veľkosťou 583 bp . C Genomický obsah transformovaných kvasiniek bol extrahovaný a podrobený sekvenovaniu s použitím priméru URA3-Pro. Sekvenovaná oblasť pozostáva z bsd v centrálnej oblasti a sekvencie obklopujúcej ura3 na 5'- a 3'-koncoch.
2.3 . Konštrukcia plazmidu
Expresná kazeta PADH1 -URA3 bola klonovaná z pCAP-BAC pomocou PCR ( Bauman et al., 2019 ). Kazeta PADH1 -URA3 sa potom vložila do hlavného reťazca pGF medzi miesto priameho priméru M13 a promótor SP6 pomocou súpravy ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit podľa protokolu výrobcu (Vazyme). Výsledný vektor bol označený ako pGFCS (pGF s negatívnym selekčným markerom, obr. 2A; úplná sekvencia je pripojená v doplnkových materiáloch).
- Stiahnuť : Stiahnite si obrázok vo vysokom rozlíšení (507 KB)
- Stiahnuť : Stiahnite si obrázok v plnej veľkosti
Obr . Príprava pGFCS s možnosťou duálneho výberu vo VL6-48B. Plazmidová mapa pGFCS . Kvasinkový-bakteriálny kyvadlový plazmid pGFCS sa vytvoril vložením PADH1 -URA3 expresnej kazety do pGF. B Reštrikčný profil pGF a pGFCS. Na overenie konštrukcie pGFCS sa uskutočnilo reštrikčné štiepenie KpnI . Produkty štiepenia pGF a pGFCS sa oddelili gélovou elektroforézou a porovnali sa s počítačom predpovedaným reštrikčným vzorom KpnI (ľavý panel). C Duálny výber vo VL6-48B. Tri kyvadlové plazmidy, pGF, pGFCS a pGFCS-A66-70 (pGFCS s 15 kbinzercia fragmentu DNA ), boli transformované do buniek VL6-48B. Transformované a netransformované kvasinky sa kultivovali na SD/-His agarových platniach doplnených 5-FOA.
2.4 . Vírusová sekvencia
5'-koniec (1–55543 bp) genómu kmeňa MPXV Congo_2003_358 (prírastok GenBank DQ011154.1 ) bol chemicky syntetizovaný. Syntetizovaná vírusová genómová DNA obsahuje štyri súvislé segmenty. Každý vírusový segment mal dĺžku približne 15 kb ( obr. 3 A), so 100 bp prekrytím medzi susednými segmentmi.
- Stiahnuť : Stiahnite si obrázok vo vysokom rozlíšení (987 KB)
- Stiahnuť : Stiahnite si obrázok v plnej veľkosti
Obr . Zostavenie fragmentu MPXV pomocou TAR. Schéma fragmentov DNA na zostavenie TAR. TAR vektor pGFCS bol linearizovaný do dvoch PCR amplikónov s pármi primérov 60-ADH1/ARS-HIS3 a HIS3-ARS/55483-URA3. Výsledné vektorové časti a štyri súvislé segmenty MPXV (žltý obdĺžnik) sa čiastočne prekrývali a tvorili kruhový YAC/BAC. Relatívne umiestnenie každého priméru je vyznačené v diagrame. B Validácia montážnych produktov pomocou multiplexnej PCR . Z pGFCS-transformantov sa vybralo šestnásť kvasinkových kolónií a obsah DNAboli extrahované ako templát pre multiplexnú PCR. Na overenie produktov zostavy TAR sa použilo päť párov primérov anelovaných ku každému rekombinantnému miestu TAR v protismere a po smere (zakreslené v A ). PCR amplikóny sa podrobili gélovej elektroforéze. Legitímny montážny produkt by mal generovať päť amplikónov pomocou multiplexnej PCR s veľkosťou 582 bp (primérový pár: ADH1/411), 291 bp (primérový pár: 14136/14426), 411 bp (primérový pár: 26501/26911), 348 bp (primérový pár pár: 40873/41220) a dĺžku 665 bp (primárny pár: 55377/URA3). Recirkularizovaný vektor by mal generovať jediný amplikón s dĺžkou 653 bp. Typický pruh obsahujúci päť správnych amplikónov je označený v červenom rámčeku. Tabuľka v spodnej časti ukazuje veľkosť každého amplikónu a pomer legitímnych montážnych produktov z troch nezávislých montážnych experimentov TAR (TAR #1, #2 a #3). CGenotypizácia produktu montáže. Vzor obmedzenia montážneho produktu. Jeden z kandidátskych produktov zostavy bol extrahovaný z VL6-48B a transformovaný na EPI300 na vysokoúčinnú amplifikáciu. Výsledná DNA bola extrahovaná a štiepená BamHI . Reštrikčné fragmenty boli oddelené gélovou elektroforézou a boli porovnané s počítačom predpovedaným BamHI reštrikčným vzorom (ľavý panel).
2.5 . Montáž TAR
Vektor TAR pGFCS sa linearizoval pomocou dvoch PCR s použitím párov primérov ARS-HIS3/60-ADH1 a HIS3-ARS/55483-URA3 (schéma na obr. 3A). Výsledné dva fragmenty PCR sa na jednom konci prekrývali medzi ARS a PHIS3 a ostatné konce sa prekrývali s 1–60 bp alebo 55483–55543 bp MPXV ( obr. 3 A). Potom sa rovnaké molárne množstvá (0, 05 pmol) pGFCS amplikónov a vírusových fragmentov zmiešali a transformovali do kompetentných VL6-48B elektroporáciou, ako je opísané v predchádzajúcej časti. Transformované kvasinky sa kultivovali na SD/-His agarových platniach doplnených 5-FOA (1 mg/ml). Pri 72 hpt sa vybralo 16 kvasinkových kolónií z pGFCS transformantov a obsah DNA sa extrahoval a podrobilmultiplexný PCR test .
2.6 . Multiplexná PCR
Multiplexná PCR sa uskutočnila pridaním uvedených párov primérov (0, 1 μmol / l každého priméru) a 1 μl každého zostavovacieho produktu do 2 x multiplexného pufra súpravy Multiplex PCR (Vazyme). Program multiplexnej PCR reakcie bol nasledujúci: denaturácia DNA pri 95 °C počas 5 minút; 35 cyklov 95 °C počas 30 s, 60 °C počas 90 s, 72 °C počas 45 s; a 72 °C počas 10 minút ako konečné predĺženie.
2.7 . Kvantitatívna PCR
Priméry a sondy na detekciu pan-ortopoxvírusov (E9L) a kmeňov MPXV z povodia Konga (C3L) pomocou qPCR boli opísané skôr ( Kulesh a kol., 2004 ; Li a kol., 2010 ). Zostavený produkt bol sériovo zriedený na 1 x 101 – 109 kópií/μl a jeden μl každého riedenia bol podrobený testu qPCR ako templát. Reakcia qPCR bola pripravená zmiešaním požadovaných zložiek (priméry, sonda a templát) s Taq Pro HS Universal Probe Master mix (Vazyme). Počet kópií genómových fragmentov MPXV sa meral pomocou systému PCR v reálnom čase ABI QuantStudio 6 Flex.
3 . Výsledky
3.1 . Chromozomálna substitúcia ura3-52
Pretože ura3 bol pridaný do hlavného reťazca vektora ako negatívny selekčný marker, sekvencia ura3-52 v genóme VL6-48 sa musí odstrániť, aby sa zabránilo rekombinácii vektora s kvasinkovým chromozómom. Genotypizácia kvasiniek rezistentných na blasticidín ukázala, že z transformovaných kvasiniek sa amplifikoval 583-bp produkt PCR , ktorý je identický s vypočítanou dĺžkou inzercie bsd ( obr. 1 B). Sekvenovanie genómovej DNA kvasiniek potvrdilo, že gén bsd bol vložený do kódujúcej oblasti ura3-52 ( obr. 1C ). Preto boli transformované kvasinky označené ako VL6-48B.
3.2 . Konštrukcia TAR vektora s dvojitým výberom markerov
Na prípravu pGFCS sa expresná kazeta PADH1-URA3 vložila do hlavného reťazca vektora pGF ( obr. 2 A). Zostavený plazmid bol validovaný štiepením KpnI a reštrikčný vzor bol identický s počítačom predpovedaným vzorom ( obr. 2 B). Aby sa otestovalo, či sa pGFCS môže použiť pri duálnej selekcii, pGF alebo pGFCS sa transformovali do buniek VL6-48B kultivovaných na SD/-His agarových platniach doplnených 5-FOA (1 mg/ml). Ako sa očakávalo, samotná VL6-48B nedokázala vytvoriť žiadne kolónie na SD/-His agarových platniach ( obr. 2 C). Transformácia pGF do VL6-48B viedla k vytvoreniu kvasinkových kolónií na SD/-His agarových platniach pri 48 hpt ( obr. 2C), čo naznačuje, že expresná kazeta PHIS3 – HIS3 poskytuje pozitívny selekčný marker na podporu rastu VL6-48B v médiu bez histidínu. Na rozdiel od toho, transformant pGFCS nedokázal vytvoriť kolónie ani pri 72 hpt v prítomnosti 5-FOA ( obr. 2 C), čo naznačuje, že kazeta PADH1 -URA3 pGFCS slúži ako negatívny selekčný marker na zastavenie rastu kvasiniek konverziou 5-FOA na cytotoxický 5-fluóruracil. Po vložení 15-kb fragmentu DNA do pGFCS medzi PADH1 a URA3 sa výsledný konštrukt transformoval do VL6-48B. Pri 48 hpt bolo možné vidieť kolónie kvasiniek na SD/-His agarovej platni doplnenej 5-FOA ( obr. 2C), čo naznačuje, že expresia URA3 bola zrušená inzerciou DNA. Celkovo možno povedať, že transformácia pGFCS na VL6-48B umožňuje duálnu selekciu na skríning kvasinkových transformantov.
3.3 . Zostavenie genómového fragmentu MPXV pomocou TAR
Na prípravu detekčného templátu qPCR pre MPXV sa použil pGFCS ako vektor TAR na zachytenie a zostavenie štyroch syntetizovaných segmentov MPXV do jedného veľkého fragmentu vo VL6-48B. Na skríning kandidátskych produktov zostavy sa uskutočnila multiplexná PCR . Päť párov primérov ( doplnková tabuľka S1 ), ktoré nasadajú na upstream a downstream oblasti každého rekombinačného miesta TAR ( obr. 3 A), sa použilo na validáciu produktov zostavy. Legitímny montážny produkt by mal generovať päť multiplexných amplikónov, veľkosť 582 bp (primérový pár: ADH1/411), 291 bp (primérový pár: 14136/14426), 411 bp (primérový pár: 26501/26911), 348 bp (primérový pár: 40873/416250), a Základný pár: 55377/URA3) na dĺžku. Ak niekedy došlo k recirkularizácii vektora, potom by mal byť vytvorený jeden amplikón s dĺžkou 653 bp pomocou páru primérov ADH1/URA3 zahrnutého v zmesi primérov. Multiplexné PCR testy troch nezávislých experimentov zostavenia TAR ukázali, že v priemere 79 % pGFCS-transformantov obsahovalo legitímne produkty zostavenia ( obr. 3 B). Je pozoruhodné, že žiadny z týchto transformantov negeneroval jediný amplikón s veľkosťou 653 bp, čo naznačuje, že recirkularizácia vektora bola účinne zrušená ( obr. 3B). Na ďalšiu validáciu zostaveného produktu sa jeden z transformantov pGFCS so správnym vzorom multiplexného amplikónu transformoval do EPI300 na vysoko účinnú amplifikáciu plazmidu. Amplifikované plazmidy sa podrobili štiepeniu reštrikčnými enzýmami pomocou BamHI a reštrikčný vzor bol identický s počítačom predpovedaným vzorom ( obr. 3C). Montážny produkt bol potvrdený Sangerovým sekvenovaním (doplnkový materiál).
3.4 . Kvantifikácia produktu montáže pomocou qPCR
Primárnym účelom zostavenia fragmentu genómu MPXV je poskytnúť nukleotidový templát na detekciu MPXV. Vynesením hodnôt Ct proti počtu kópií v každom riedení sa nakreslili lineárne regresné čiary. Koeficient determinácie (R2) E9L bol 0,9968 a koeficient C3L bol 0,9981, čo naznačuje, že každá qPCR vykazovala silný lineárny vzťah medzi strednými hodnotami Ct a logaritmom koncentrácie templátovej DNA ( obr. 4 ).
- Stiahnuť : Stiahnite si obrázok vo vysokom rozlíšení (168 KB)
- Stiahnuť : Stiahnite si obrázok v plnej veľkosti
Obr . Štandardné krivky z testov qPCR. Desaťnásobné riedenia zostaveného fragmentu MPXV v rozsahu od 1 × 101 – 109 kópií na reakciu sa merali pomocou qPCR. Vypočítané Ct predstavuje priemer z 3 rôznych testov. Uvádza sa najvhodnejšia línia a koeficienty determinácie (R2 ) E9L ( A ) a C3L ( B ).
4 . Diskusia
HR sa vyskytuje vo všetkých typoch buniek ako základný nástroj na opravu DNA s dvojvláknovými zlommi (DSB). Prostredníctvom aktivityRad52[prehľad v (Paques a Haber, 1999)] je oprava DNA sprostredkovaná HR procesom s vysokou presnosťou. Na rozdiel od HR,Kuzávislá NHEJ poskytuje alternatívnu opravnú dráhu pre zlomy DNA [zhrnuté v (Critchlow a Jackson, 1998)], vyznačujúce sa priamou ligáciou dvoch zlomových koncov bez potreby homológneho templátu. Nedávno bol MMEJ definovaný ako nový typ opravy DNA v bunkách cicavcov a kvasinkových bunkách ( Ma et al., 2003). MMEJ je závislý na Mre11 , Rad50 a Rad1 ( Ma et al., 2003 ) a opravuje lézie DNA spôsobom náchylným na chyby. Na zostavenie legitímnych produktov pomocou TAR sa vyžaduje HR skôr ako NHEJ alebo MMEJ, pretože posledné dva zvyčajne vedú k vektorovej recirkularizácii alebo nelegitímnym rekombináciám produktov kvôli ich povahe náchylnej na chyby.
V tejto štúdii sme demonštrovali, že zavedenie P ADH1 -URA3 do hlavného reťazca vektora môže účinne zrušiť recirkuláciu vektora počas zostavovania TAR prostredníctvom postupu negatívnej selekcie. Legitímny produkt zostavy TAR sa však získa prostredníctvom viacerých HR udalostí v závislosti od počtu fragmentov DNA, ktoré sa majú zostaviť. Hoci súčasný systém duálnej selekcie môže účinne zaručiť, že fragmenty DNA ( napr. fragmenty hlavného reťazca vektora v tejto štúdii) nesúce markery negatívnej selekcie sa rekombinujú s homológnymi sekvenciami prostredníctvom HR, nie je schopný zabrániť ďalším fragmentom DNA bez negatívneho selekčného markera ( napr. MPXV segmenty v tejto štúdii) z rekombinácie s nehomologickými sekvenciami prostredníctvom dráh opravy DNA náchylných na chyby, ako sú NHEJ alebo MMEJ. Toto obmedzenie môže prispieť k nelegitímnym montážnym produktom prezentovaným v našej montáži TAR pomocou systému dvojitého výberu.
Na zlepšenie účinnosti zostavy TAR bolo navrhnutých niekoľko stratégií založených na modifikácii TAR vektorov alebo kvasinkových kmeňov. Kuijpers a kol. navrhli súbor štandardizovaných 60-bp syntetických rekombinantných sekvencií nehomológnych s kvasinkovým genómom ( Kuijpers et al., 2013 ). Tieto sekvencie sa zaviedli do každého boku fragmentov zostavy ako „zachytávacie háčiky“, aby sa rekombinovali so susednými fragmentmi pomocou HR. Aj keď je možné pomocou štandardizovaných záchytných hákov dosiahnuť vynikajúcu efektivitu montáže, výsledný montážny produkt je týmito háčikmi prerušovaný a je nevhodný pre bezproblémovú montáž. Mila Vrancic a spol. navrhol pripraviť mutantný kmeň kvasiniek s narušenými hlavnými zložkami NHEJ ( Vrančić et al., 2008). Nelegitímna ligácia pomocou NHEJ by teda bola potlačená a účinnosť TAR by sa následne zvýšila v tomto konkrétnom kvasinkovom kmeni s defektom NHEJ. Avšak aspoň dve dráhy opravy DNA náchylné na chyby môžu prispieť k recirkularizácii vektora alebo k nelegitímnym produktom zostavovania. Okrem toho nie je jasné, ktorá cesta, NHEJ alebo MMEJ, hrá hlavnú úlohu vo vyššie uvedenej situácii. Budúce snahy o optimalizáciu TAR by mali deaktivovať viac cieľov zapojených do NHEJ aj MMEJ.
Ako účinný nástroj na zostavenie veľkých fragmentov DNA až do dĺžky 592 kb ( Gibson et al., 2008 ) sa zostavenie TAR stalo nevyhnutným na prípravu infekčných klonov veľkých DNA/RNA vírusov. S použitím pGF ako vektora TAR, Shang et al. zostavili syntetický bakulovírus s dĺžkou genómu viac ako 145 kb ( Shang et al., 2017 ). Na vytvorenie systému reverznej genetiky pre SARS-CoV-2 spoločný tím úspešne zostavil kompletný cDNA klon SARS-CoV-2 za menej ako týždeň pomocou zostavy TAR ( Thi Nhu Thao et al., 2020). Tento nástroj na zostavenie DNA aplikovaný vo virologickom výskume by však mohol vyvolať aj potenciálne bezpečnostné obavy, najmä ak zostavený produkt obsahuje kompletný súbor genetického materiálu, ktorý možno obnoviť na nákazlivý patogén. Nedávno bola skupina vedcov financovaná biotechnologickou spoločnosťou, aby syntetizovala kompletný genóm vírusu konských kiahní a obnovila ho na infekčný vírus ( Noyce et al., 2018 ). Nie je prekvapením, že takýto kontroverzný úspech si získal obrovskú pozornosť a vyvolal celosvetovú diskusiu o jeho dôsledkoch biologickej bezpečnosti ( DiEuliis a kol., 2017 ; Koblentz, 2017 , 2018 ; DiEuliis a Gronvall, 2018). V tejto štúdii, hoci by bol vírusový genóm plnej dĺžky ideálnym referenčným templátom na detekciu MPXV pomocou qPCR, snažili sme sa zostaviť iba 55-kb vírusový fragment, čo je menej ako jedna tretina genómu MPXV. Tento montážny produkt je bezpečný pri poruche tým, že prakticky eliminuje akékoľvek riziko premeny na infekčný vírus a zároveň poskytuje viacero cieľov qPCR na detekciu MPXV alebo iných orthopoxvírusov ( Li et al., 2010 ).
5 . Závery
Stručne povedané, naša štúdia preukázala, že kazeta P ADH1 -URA3 môže účinne zrušiť recirkuláciu vektora počas zostavovania TAR, čím podporuje potenciálne použitie TAR v genomike a reverznej genetike. Stále je však potrebné vykonať viac výskumov, aby sa ďalej optimalizovala účinnosť zostavovania TAR a aby sa spresnili administratívne pravidlá týkajúce sa otázok biologickej bezpečnosti súvisiacich so zostavovaním DNA
Zdroj štúdie: : sciencedirect.com
Príloha A. Doplňujúce údaje
Toto sú doplňujúce údaje k tomuto článku:
Multimediálny komponent 1 .
- Bauman a kol., 2019
-
K.D. Bauman, J. Li, K. Murata, S.M. Mantovani, S. Dahesh, V. Nizet, H. Luhavaya, B.S. MooreRefaktorovanie kryptického streptofenazínového biosyntetického génového klastra spája fenazín, polyketid a biochémiu neribozomálnych peptidovCell Chem. Biol. , 26 ( 2019 ) , s. 724 - 736e727
- Brown a Leggat, 2016
-
K. Brown , PA LeggatĽudské opičie kiahne: súčasný stav poznania a dôsledky pre budúcnosťTrav. Med. Infikovať. Dis. , 1 ( 2016 ) , s. 8
- Critchlow a Jackson, 1998
-
SE Critchlow , SP JacksonSpájanie koncov DNA: od kvasiniek k človekuTrends Biochem. Sci. 23 ( 1998 ) , str . 394-398 _
- DiCarlo a kol., 2013
-
DiCarlo JE , Norville JE , Mali P , Rios X , Aach J , GM ChurchGenómové inžinierstvo v Saccharomyces cerevisiae pomocou systémov CRISPR-CasNucleic Acids Res. , 41 ( 2013 ) , s. 4336 - 4343
- DiEuliis a kol., 2017
-
D. DiEuliis, K. Berger, G. GronvallDôsledky biologickej bezpečnosti pre syntézu konských kiahní, ortopoxvírusuHealth Secur. , 15 ( 2017 ) , s. 629 - 637
- DiEuliis a Gronvall, 2018
-
D. DiEuliis, G.K. GronvallHolistické hodnotenie rizík a prínosov syntézy vírusu konských kiahnímSphere , 3 ( 2018 ) , s. e00074 - 18
- Furter-Graves a Hall, 1990
-
EM Furter-Graves , BD HallElementy sekvencie DNA potrebné na iniciáciu transkripcie génu ADH Schizosaccharomyces pombe v Saccharomyces cerevisiaeMol. Genet. , 223 ( 1990 ) , s. 407 - 416
- Gibson a kol., 2008
-
DG Gibson , GA Benders , KC Axelrod , J. Zaveri , MA Algire , M. Moodie , MG Montague , JC Venter , HO Smith , CA Hutchison 3rdJednostupňové zostavenie 25 prekrývajúcich sa fragmentov DNA v kvasinkách na vytvorenie kompletného syntetického genómu Mycoplasma genitaliumProc. Natl. Akad. Sci. USA , 105 ( 2008 ) , s. 20404 - 20409
- Hou a kol., 2016
-
Z. Hou, Z. Zhou, Z. Wang, G. XiaoZostavenie dlhých sekvencií DNA pomocou nového syntetického kyvadlového vektora Escherichia coli-kvasinkyVirol. Bez. , 31 ( 2016 ) , s. 160 - 167
- Koblentz, 2017
-
GD KoblentzDe novo syntéza vírusu kiahní: dôsledky pre biologickú bezpečnosť a odporúčania na prevenciu opätovného výskytu kiahníHealth Secur. , 15 ( 2017 ) , s. 620 - 628
- Koblentz, 2018
-
GD KoblentzKritická analýza vedeckých a komerčných dôvodov de novo syntézy vírusu konských kiahnímSphere , 3 ( 2018 ) , s. e00040 - 18
- Kouprina a Larionov, 2016
-
N. Kouprina, V. LarionovKlonovanie s transformáciou spojenou rekombináciou (TAR) pre genomické štúdie a syntetickú biológiuChromosoma , 125 ( 2016 ) , str. 621 - 632
- Kuijpers a kol., 2013
-
NG Kuijpers , D. Solis-Escalante , L. Bosman , M. van den Broek , JT Pronk , JM Daran , P. Daran-LapujadeVšestranná a účinná stratégia na zostavenie viacfragmentových expresných vektorov v Saccharomyces cerevisiae s použitím 60 bp syntetických rekombinantných sekvenciíMicrob. Cell Factory , 12 ( 2013 ) , s. 47
- Kulesh a kol., 2004
-
DA Kulesh , RO Baker , BM Loveless , D. Norwood , SH Zwiers , E. Mucker , C. Hartmann , R. Herrera , D. Miller , D. Christensen , LP Wasieloski Jr. , J. Huggins , PB JahrlingDetekcia vírusu pravých kiahní a panortopoxových kiahní pomocou 3'-minor groove binderov v reálnom čase testov TaqMan na platformách roche LightCycler a Cepheid smart CyclerJ. Clin. Microbiol. , 42 ( 2004 ) , str . 601-609
- Larionov a kol., 1994
-
V. Larionov, N. Kouprina, N. Nikolaishvili, M.A. ResnickRekombinácia počas transformácie ako zdroj chimérických cicavčích umelých chromozómov v kvasinkách (YAC)Nucleic Acids Res. , 22 ( 1994 ) , strany 4154 - 4162
- Lewis a Resnick, 2000
-
LK Lewis , MA ResnickViazanie voľných koncov: nehomologické spájanie koncov v Saccharomyces cerevisiaeOn sa mení. Veci. , 451 ( 2000 ) , str 71 - 89
- Li a kol., 2010
-
Li Y. , Zhao H. , Wilkins K. , Hughes C. , Damon IKTesty PCR v reálnom čase na špecifickú detekciu DNA kmeňa vírusu opičích kiahní v západnej Afrike a povodí KongaJ. Virol. Methods , 169 ( 2010 ) , s. 223 - 227
- Ma a kol., 2003
-
JL Ma , EM Kim , JE Haber , SE LeeKvasinkové proteíny Mre11 a Rad1 definujú Ku-nezávislý mechanizmus na opravu dvojvláknových zlomov, ktorým chýbajú prekrývajúce sa koncové sekvencieMol. Cell Biol. , 23 ( 2003 ) , strany 8820 - 8828
- Miret a kol., 1998
-
JJ Miret , L. Pessoa-Brandao , RS LahueOrientačne závislé a sekvenčne špecifické expanzie CTG/CAG trinukleotidových opakovaní v Saccharomyces cerevisiaeProc. Natl. Akad. Sci. USA , 95 ( 1998 ) , s. 12438 - 12443
- Noskov a kol., 2001
-
V.N. Noskov, M. Koriabine, G. Solomon, M. Randolph, J.C. Barrett, S.H. Leem, L. Stubbs, N. Kouprina, V. LarionovDefinovanie minimálnej dĺžky sekvenčnej homológie potrebnej na selektívnu izoláciu génu klonovaním TARNucleic Acids Res. , 29 ( 2001 ) , s. E32
- Noskov a kol., 2003
-
V.N. Noskov, N. Kouprina, S.H. Leem, I. Ouspenski, J.C. Barrett, V. LarionovVšeobecný klonovací systém na selektívnu izoláciu akejkoľvek eukaryotickej alebo prokaryotickej genómovej oblasti v kvasinkáchBMC Genom. , 4 ( 2003 ) , s. 16
- Noyce a kol., 2018
-
RS Noyce , S. Lederman , DH EvansKonštrukcia infekčnej vakcíny proti vírusu konských kiahní z chemicky syntetizovaných fragmentov DNAPLoS One , 13 ( 2018 ) , článok e0188453
- Paques a Haber, 1999
-
F. Paques , J. E. HaberViacnásobné cesty rekombinácie indukované dvojvláknovými zlomami v Saccharomyces cerevisiaeMicrobiol. Mol. Biol. Rev . , 63 ( 1999 ) , strany 349 - 404
- Shang a kol., 2017
-
Y. Shang, M. Wang, G. Xiao, X. Wang, D. Hou, K. Pan, S. Liu, J. Li, J. Wang, B.M. Arif, J.M. Vlak, X. Chen, H. Wang, F. Deng, Z. HuKonštrukcia a záchrana funkčného syntetického bakulovírusuACS Synth. Biol. , 6 ( 2017 ) , s. 1393 - 1402
- Thi Nhu Thao a kol., 2020
-
T. Thi Nhu Thao , F. Labroussaa , N. Ebert , P. V'Kovski , H. Stalder , J. Portmann , J. Kelly , S. Steiner , M. Holwerda , A. Kratzel , M. Gultom , K. Schmied , L. Laloli , L. Husser , M. Wider , S. Pfaender , D. Hirt ,V. Cippa, S. Crespo-Pomar, S. Schroder, D. Muth, D. Niemeyer, V.M. Corman, M.A. Muller, C. Drosten, R. Dijkman, J. Jores, V. ThielRýchla rekonštrukcia SARS-CoV-2 pomocou syntetickej genomickej platformyPríroda , 582 ( 2020 ) , s. 561 – 565
- Vrančić a kol., 2008
-
M. Vrančić , S. Gregorić , A. Paravić Radičević , K. GjuračićRekombinovanie genómu cicavcov: kvasinky sú stále výberovým pomocným mikroorganizmom?Food Technol. Biotechnol. , 46 ( 2008 ) , s . 237-251
- Wild a Szybalski, 2004
-
J. Wild , W. SzybalskiPrísne regulované expresné vektory s kontrolou kopírovania založené na pBAC/oriVMetódy Mol. Biol. , 267 ( 2004 ) , s. 155 - 167
O AstraZeneca ešte v minulom roku sme dávali, že momentálne prebiehajú klinické skúšky a aj zloženie: https://www.dostojneslovensko.eu/sk/zdravie-a-pravo/informacie-o-vakcinach/213-20-9-21-klinicke-studie-do-roku-2025-astrazeneca-pre-deti-do-18-rokov-3. Zaujímavé aké má zloženie. Samozrejme, že vtedy to nikoho nezaujímalo, a dnes?
Na rozdiel od mnohých iných nemá Oz Dôstojnosť Slovenska žiadnych akcionárov ani miliardárskeho vlastníka. Len odhodlanie a vášeň poskytovať nielen vysoko účinné globálne spravodajstvo, vždy bez komerčného alebo politického vplyvu. Takéto podávanie správ je životne dôležité pre demokraciu, spravodlivosť a požiadavku na lepšie od mocných.
A to všetko poskytujeme zadarmo, aby si to mohol prečítať každý. Robíme to preto, lebo veríme v informačnú rovnosť. Väčšie množstvo ľudí môže sledovať globálne udalosti, ktoré formujú náš svet, pochopiť ich vplyv na ľudí a komunity a inšpirovať sa k zmysluplným krokom. Milióny ľudí môžu ťažiť z otvoreného prístupu ku kvalitným a pravdivým správam bez ohľadu na ich schopnosť zaplatiť za ne.
Spracoval: ® OZ Dôstojnosť Slovensko Všetky práva vyhradené!!
Neziskový sektor: SLSP
Názov účtu: Dôstojnosť Slovenska
SK28 0900 0000 0051 7971 8989
Všetky práva vyhradené OZ Dôstojnosť Slovenska. Zdieľanie dovolené.
V spolupráci so zahraničnými agentúrami.
