Hystéria vtáčej chrípky sa zameriava na mačky. Mohli by spustiť novú pandémiu, varujú. V mene zdravia by sa ľudia mali čoskoro zdržať domácich miláčikov.
Nová umelá panika zapadá do konceptu „One Health“ a „Great Reset“. Vedci tvrdia, že mačky by mohli byť zvieratami, u ktorých vtáčia chrípka zmutuje, aby sa mohla rozšíriť na ľudí. CDC odporúča vyhýbať sa „alebo priamemu fyzickému kontaktu“ s chorými mačkami, ktoré mohli byť vystavené vírusu.
⇓Povinné čítanie⇓
One Health for Great Reset so 4 medzinárodnými organizáciami: WHO, FAO, OIE a UNEP ,
Koncept (Agenda) „Jedno zdravie“!! ,
Európska komisia robí zdravie globalistickým namiesto individuálneho s konceptom „Jedno zdravie“.
Antibakteriálna rezistencia (koniec antibiotikám a príchod vakcín)
Kto by to bol povedal? Po dvoch rokoch, keď sme my ľudia museli nosiť masky a udržiavať si odstup, je teraz zrejme rad na našich mrniacich spolubývajúcich. Samozvaní pandemickí strážcovia objavili nového strašiaka: domácu mačku ako potenciálnu živnú pôdu pre ďalšiu veľkú epidémiu.
Čítaj !!
Mačky ako nosiče
To, čím bývali prasatá, budú čoskoro mačky. Ošípané boli predtým považované za jednu z najväčších zoonotických hrozieb pre verejné zdravie, pretože ich bunky môžu umožniť vírusom miešať sa a mutovať. Takto vznikla prasacia chrípka H1N1.
Nová štúdia sa však teraz zameriava na domáce mačky, ktoré by mohli byť rovnako „nebezpečné“ ako ošípané. +Štúdia publikovaná minulý týždeň v časopise Emerging Microbes & Infections ( správy Telegraph ) zistila, že mačky, podobne ako ošípané, majú bunkové receptory, ktoré im umožňujú pôsobiť ako „miešacie nádoby na preskupenie vírusov vtáčej a cicavčej chrípky“. .
Zistilo sa tiež, že mačky, ktoré nedávno zomreli na vtáčiu chrípku H5N1, mali „jedinečné mutácie“, ktoré naznačujú „potenciálnu vírusovú adaptáciu“.
„Trvalá expozícia, vírusová cirkulácia a adaptácia vírusu H5N1 u mačiek vyvolávajú značné obavy z prenosu a verejného zdravia,“ uviedli autori štúdie z University of Pittsburgh.
Existuje napríklad zmienka o Texase, kde sa 24 mačiek nakazilo H5N1 po vypití surového mlieka zo stajní, kde sa choval chorý dobytok. Alebo v Colorade, kde sa nakazili tri domáce mačky. „Odborníci“ sa domnievajú, že sa nakazili pri love infikovaných myší.
Nie je náhoda, že domáce zvieratá, pôvodne mačky, sú teraz cieľom pandemického priemyslu. To je v súlade s ideológiou „Jedno zdravie“. Ľudské zdravie preto nemožno oddeliť od zdravia životného prostredia. Takže ak má domáce zviera pozitívny test PCR, vážne ohrození sú aj ľudia. Skutočné príznaky choroby sú irelevantné.
Navyše, domáce zvieratá sú už dlho tŕňom v oku klimatickej agendy. Psy a mačky využívajú príliš veľa zdrojov a produkujú príliš veľa CO2. Prekážka v „klimaticky neutrálnej“ fantázii. Útok na mačky a psy by nebol prekvapením.
Štúdia z University of Pittsburgh, ktorá bola nedávno publikovaná v časopise „Emerging Microbes & Infections“ s názvom „ Výrazný neurotropizmus a potenciálna adaptácia vírusu H5N1 kladu 2.3.4.4.b u prirodzene infikovaných domácich mačiek “ priamo ukazuje diabla: naše domáce mačky by mohli byť „ Pre chrípkové vírusy sa používajú zmiešavacie nádoby – termín, ktorý znie, ako keby ho Mary Shelley vymyslela pre „Frankenstein“.
"Dôkaz"? V Texase sa 24 mačiek nakazilo H5N1 potom, čo – počúvajte a čudujte sa – olizovali surové mlieko od chorého dobytka. Správanie, o ktorom je známe, že je súčasťou štandardného repertoáru našich domácich mačiek. V Colorade boli zabití ďalší traja chlpatí priatelia, pravdepodobne po love infikovaných myší.
To, čo tu znie ako vedecká prísnosť, podozrivo zaváňa ďalším kolom veľkého pandemického monopolu. Obzvlášť pikantné: Nová mačacia hystéria sa hodí ako uliata do globalistickej doktríny „One Health“, ideologického konštruktu, ktorý hádže ľudí, zvieratá a životné prostredie do jedného hrnca a energicky ním mieša.
Posolstvo je jemné ako kladivo: najprv to boli netopiere, potom prasatá a teraz mačky. Ďalší logický krok? Pravdepodobne odporúčanie poslať našich miláčikov „preventívne“ do karantény alebo sa ich úplne zbaviť – samozrejme v prospech verejného zdravia a tiež klímy, pretože ekologická stopa našich štvornohých priateľov bola vždy tŕňom v oku obvyklých podozrivých.
Osvedčený vzorec je opäť zrejmý: Vezmite si niekoľko jednotlivých prípadov, ozdobte ich „jedinečnými mutáciami“ a „potenciálnou adaptáciou vírusu“ a ďalšia polievka strachu je hotová. Zdá sa, že nikomu nevadí, že zdravý rozum ide bokom. Iróniou je, že kým sme stále zaneprázdnení zbieraním kúskov poslednej pandemickej paniky, kurz sa už pripravuje na ďalšiu. Tentoraz s našimi pradiacimi spoločníkmi v hlavnej úlohe.
Chcelo by sa zakričať samozvaným apoštolom zdravia: Odíďte konečne z kostola v dedine – a mačka na pohovke! Ale na to je už asi neskoro. Stroj sa spustil a nezastaví sa tak ľahko. Koniec koncov, tu ide o viac než len o mačky – ide o veľkolepý príbeh o neustálej hrozbe, ktorá nás má všetkých držať na háku.
Výrazný neurotropizmus a potenciálna adaptácia vírusu H5N1 kladu 2.3.4.4.b u prirodzene infikovaných domácich mačiek
ABSTRAKT
V apríli 2024 zomrelo vo vidieckom sídle v Južnej Dakote (SD) desať mačiek, ktoré vykazovali respiračné a neurologické symptómy. Pitva a laboratórne testovanie dvoch mačiek potvrdilo infekciu H5N1 kladu 2.3.4.4b. Sekvencie vírusového genómu úzko súvisia s nedávnymi sekvenciami H5N1 SD dobytka. Genómy Cat H5N1 mali jedinečné mutácie, vrátane T143A v hemaglutiníne, o ktorých je známe, že ovplyvňujú infekčnosť a imunitný únik, a dve nové mutácie v PA proteíne (F314L, L342Q), ktoré môžu ovplyvniť aktivitu polymerázy a virulenciu, čo naznačuje potenciálnu adaptáciu vírusu. Mŕtve mačky vykazovali systémovú infekciu s léziami a vírusovými antigénmi vo viacerých orgánoch. Vyššia vírusová RNA a antigén v mozgu indikovali výrazný neurotropizmus. Lektínová histochémia odhalila rozšírenú koexpresiu a-2,6 a a-2,3 receptorov kyseliny sialovej, čo naznačuje, že mačky by mohli slúžiť ako miešacie nádoby na preskupenie vírusov vtáčej a cicavčej chrípky. Žiadne rozdiely vo väzbe pseudovírusov H5 kladu 2.2 alebo 2.3.4.4b na tkanivá pľúc/mozgu mačky nenaznačujú, že neurotropizmus je nepravdepodobný sprostredkovaný väzbovou afinitou k receptoru.
Úvod
Od prvého objavu vysoko patogénneho vírusu vtáčej chrípky (HPAIV) podtypu H5N1 z husi v Guangdongu v Číne v roku 1996 sa vírus diverzifikoval do desiatich kladov (klady 0–9) a podtriedov [Citácia1 ]. V roku 2020 kmeň H5N8 patriaci do kladu 2.3.4.4b spôsobil infekcie medzi domácimi a voľne žijúcimi vtákmi v Európe, Afrike a Ázii, čo viedlo k novým preskupeným kmeňom, ako je klad 2.3.4.4b H5N1 [Citácia2 ]. Od prvej detekcie v Holandsku v októbri 2020 boli prepuknutia vírusu H5N1 clade 2.3.4.4b hlásené vo viacerých európskych krajinách, Afrike, Ázii a Amerike [Citácia3 ]. Geografické rozšírenie a rozsah druhov ovplyvnených kladom 2.3.4.4b vírusov H5N1 ďaleko prevyšuje rozsah predchádzajúcich kladov H5N1. Infekcie H5N1 kladu 2.3.4.4b boli hlásené u viac ako 90 druhov voľne žijúcich a domácich vtákov a viac ako 21 druhov cicavcov vrátane hovädzieho dobytka, líšok, skunka, morských levov, noriek, delfínov, psíkov medvedíkovitých, mačiek a tuleňov [Citácia4–10 ], vrátane niekoľkých ľudských infekcií [Citácia11 ]. Väčšina infekcií cicavcov sa pravdepodobne vyskytla požitím alebo priamym kontaktom s infikovanými vtákmi, čo sa zhoršilo rozšírenou infekciou a úmrtnosťou druhov vtákov [Citácia12 ]. Bezprecedentné riziko H5N1 kladu 2.3.4.4b je zdôraznené masívnymi úmrtiami medzi uškatcami od januára do októbra 2023 v Peru, Čile, Argentíne, Uruguaji a Brazílii [Citácia6 ].
Zvieratá infikované vírusmi kladu 2.3.4.4b H5N1 bežne vykazovali pneumóniu a meningoencefalitídu, pričom u niekoľkých druhov zvierat prevládali neurologické príznaky. Najmä delfíny [Citácia8 ], skunky [Citácia13 ], norky [Citácia14 ], líšky obyčajné [Citácia15 ] a uškatce [Citácia6 ] vykazovali významné neurologické príznaky, ako sú tras, kŕče a ataxia, s vírusovou prítomnosťou hlavne v mozgu. Hoci neurotropizmus a neurologické príznaky boli pozorované počas prepuknutia predchádzajúcich kladov vírusov H5N1, výrazný neurotropizmus súčasného kladu H5N1 2.3.4.4b je zvýraznený vysokou vírusovou záťažou v mozgu a minimálnou alebo žiadnou prítomnosťou vírusu v pľúcach niekoľkých druhov [Citácia8 ,Citácia16 ], čo naznačuje významný posun v správaní vírusov.
Od marca 2024 bolo v USA zaznamenaných 21 prípadov infekcie H5N1 kladu 2.3.4.4b u mačiek [Citácia17 ]. Vnímavosť mačiek na vírusy vtáčej chrípky H5N1 sa stala známou v roku 2004. Prvý zdokumentovaný prípad prirodzenej infekcie mačiek H5N1 bol v roku 2004 v Thajsku, kde v domácnosti zomrelo štrnásť mačiek [Citácia18 ]. Závažná pneumónia u tigrov a leopardov kŕmených infikovanými telami hydiny v Thajsku zároveň rozšírila rozsah vnímavých hostiteľov vírusov H5N1 [Citácia19 ]. Experimentálna infekcia mačiek izolátom H5N1 zo smrteľného ľudského prípadu vo Vietname (klad 2.2 – A/Vietnam/1194/04) odhalila, že hoci vírus spôsobil ochorenie dolných dýchacích ciest, viedlo k úmrtiu iba jedného z troch nakazených. mačky. Predovšetkým sa nepreukázali neurologické deficity [Citácia20 ]. Následná správa z Nemecka o prirodzenej infekcii domácich krátkosrstých mačiek vírusom HPAIV H5N1 A/swan/Germany/R65/06 ukázala vyššiu vírusovú záťaž v pľúcach v porovnaní s mozgom, pričom o 3,5 loga viac vírusu v pľúcach spojené s bronchom - intersticiálna pneumónia [Citácia21 ]. Skoršie kladky H5N1 u mačiek viedli buď k subklinickým infekciám [Citácia22 ] alebo klinické ochorenie charakterizované pneumóniou a encefalitídou [Citácia23 ] a v súčasnosti cirkulujúci preskupený klad 2.3.4.4b vírus H5N1 je tiež silne spojený s respiračnými a neurologickými príznakmi u mačiek vo Francúzsku [Citácia24 ], Poľsko [Citácia25 ], Južná Kórea [Citácia26 ] a USA [Citácia4 ]. V tejto štúdii uvádzame výrazný neurotropizmus kladu 2.3.4.4b vírusov H5N1 u mačiek s hĺbkovým vyšetrením histopatologických lézií a detekciou vírusu vo viacerých orgánoch.
Kľúčovým determinantom hostiteľskej vnímavosti a tkanivového tropizmu chrípkových vírusov je schopnosť vírusového hemaglutinínu (HA) viazať sa na receptory pre kyselinu sialovú (SA) hostiteľa.Citácia27 ]. Zatiaľ čo vírusy ľudskej a iných cicavčích chrípkových vírusov vykazujú preferenčnú väzbu na SA receptory s a-2,6Gal väzbou, vírusy vtáčej chrípky, vrátane H5N1, vykazujú preferenčný tropizmus k SA receptorom s a-2,3Gal väzbou [Citácia28 ]. Distribúcia týchto receptorov sa medzi druhmi líši; napríklad ľudské epitelové bunky horných dýchacích ciest obsahujú hlavne SA α-2,6Gal receptory [Citácia29 ], zatiaľ čo SA α-2,3Gal je prevládajúcim receptorom v priedušnici kačíc a všetkých druhov Passeriformes [Citácia30 ,Citácia31 ]. Posun vo väzbovej afinite HA vírusu H5N1 z SA α-2,3 na α-2,6-receptory je rozhodujúci pre to, aby získal schopnosť prenosu z človeka na človeka [Citácia32 ]. Bolo identifikovaných niekoľko zmien aminokyselín (N182 K, Q222L/G224S alebo kombinácia N182 K/Q222L/G224S) v proteíne H5, ktoré zvyšujú väzbu na SA a-2,6-receptory [Citácia32 ]. Nedávna štúdia uviedla, že vírusy kladu 2.3.4.4b získané z mezokarnivorov v Kanade si vo svojom HA proteíne zachovali aminokyselinové zvyšky, ktoré môžu umožniť väzbu na SA a-2,6-receptory. Predovšetkým sa ukázalo, že substitúcie S137A a T160A in vitro mierne zvyšujú väzbu vírusu chrípky A (IAV) na SA a-2,6 receptory [Citácia33 ]. Neurotropizmus vírusov kladu 2.3.4.4b H5N1 u mačiek by mohol byť spôsobený rozdielmi vo vzorcoch distribúcie receptorov. Vykonali sme hĺbkové hodnotenie distribúcie SA receptorov vo viacerých orgánoch u mačiek a zistili sme rozsiahlu koexpresiu receptorov vtáčej a ľudskej chrípky vo viacerých tkanivách mačiek, bez významných rozdielov medzi pľúcami a mozgom. Tieto pozorovania dopĺňajú predtým publikovanú správu, ktorá ukázala tkanivovú distribúciu receptorov ľudského a vtáčieho vírusu kyseliny sialovej u domácich mačiek [Citácia34 ]. Ďalej sme zistili rozšírenú väzbu pseudovírusov exprimujúcich H1 a H5 z kladu 2.2 a 2.3.4.4b na tkanivá mačiek. Ďalej, žiadne výrazné rozdiely vo väzbových vzorcoch kladu 2.2 a kladu 2.3.4.4b na tkanivá pľúc a mozgu mačiek nenaznačujú, že neurotropizmus vírusov kladu 2.3.4.4b je nepravdepodobne sprostredkovaný väzbovou afinitou k receptoru.
Materiály a metódy
Živočíšne tkanivá
Dve mŕtve mačky vo veku šesť mesiacov a jeden a pol roka boli pitvané vo veterinárnom diagnostickom laboratóriu v Severnej Dakote (NDSU VDL) v apríli 2024. Klinické príznaky u týchto mačiek zahŕňajú zníženú chuť do jedla, letargiu a neurologické poruchy, ktoré viesť k úmrtnosti. Bol vytvorený komplexný súbor tkanív vrátane pľúc, obličiek, srdca, žalúdka, ilea, jejuna, dvanástnika, hrubého čreva, pankreasu, nadobličiek, veľkého mozgu, mozočku, hipokampu, mozgového kmeňa, kostrového svalstva, štítnej žľazy/prištítnych teliesok, lymfatických uzlín, pečene a sleziny. fixovaný v 10% neutrálnom pufrovanom formalíne. Fixované tkanivá podstúpili rutinné histologické spracovanie a rezy na farbenie hematoxylínom a eozínom (H&E) a imunohistochemickú analýzu. Pľúcne a mozgové tkanivá sa odobrali na extrakciu nukleovej kyseliny a PCR. Rezy zdravého tkaniva mačiek fixované vo formalíne a zaliate do parafínu boli získané od spoločnosti Zyagen v San Diegu, Kalifornia, USA. Tieto zahŕňali pľúca (FP-601), mozgovú kôru (FP-210), žalúdok (FP-302), ileum (FP-309), jejunum (FP-308) a dvanástnik (FP-307).
Kvantitatívna RT-PCR a sekvenovanie novej generácie
Extrakcia RNA a IAV matrica/H5 PCR sa uskutočnili na NDSU VDL podľa protokolov schválených NVSL. Vzorky RNA sa podrobili sekvenovaniu novej generácie v inšpekčnej službe pre zdravie zvierat USDA – National Veterinary Services Laboratories. Sekvenovanie celého genómu s párovým koncom sa uskutočnilo pomocou prístroja NextSeq 2000 Illumina. Čítania sekvencií boli odoslané do SRA, databázy NCBI (SRR29040272, SRR29040273) a zodpovedajúce kompletné génové segmenty zostavené pomocou Geneious Prime verzie 2024.0.4 boli odoslané do GISAID (EPI_ISL_19196362 a EPI_ISL_19196363).
Fylogenetická analýza
Sekvencie H5N1 HA odvodené od dvoch mačiek v tejto štúdii sa analyzovali s celkom 1 443 sekvenciami HA patriacimi do kladu H5N1 2.3.4.4b, ktoré boli stiahnuté z GISAID 7. júna 2024. Tieto sekvencie pochádzajú z ľudí (globálne), kurčiat (Severná Amerika), kačice, husi a všetky cicavce zo Severnej a Južnej Ameriky, vrátane nedávno hlásených sekvencií pochádzajúcich z infikovaných mliečneho dobytka. Z analýz sa odstránili duplicitné sekvencie s identickým zložením nukleotidov, čím sa získalo celkom 745 sekvencií dostupných na konštrukciu fylogenetického stromu. Sekvencie boli zarovnané pomocou nasledujúcich parametrov: cena otvorenia medzery = 10 a cena rozšírenia medzery = 1,0 s presným režimom zarovnania (CLC Genomics Workbench, verzia 24). Kódujúca sekvencia HA zo všetkých sekvencií bola extrahovaná zo zarovnania a podrobená testovaniu nukleotidovej substitúcie s použitím nasledujúcich modelov: Jukes-Cantor [Citácia35 ], Felsenstein81 [Citácia36 ], Kimura80 [Citácia37 ], Hasegawa-Kishino-Yano (HKY) [Citácia38 ] a General Time Reversible (GTR) (známy aj ako model REV) [Citácia39 ]. Načrtnuté modely nukleotidovej substitúcie boli testované pomocou testu hierarchického pomeru pravdepodobnosti (hLRT), bayesovského informačného kritéria (BIC), minimálneho teoretického informačného kritéria (AIC, Akaike informačné kritérium) a minimálneho opraveného teoretického informačného kritéria (AICc, AIC s korekciou pre veľkosť vzorky) na identifikáciu najlepšieho modelu konštrukcie fylogenetického stromu. Fylogenetický strom pre gén HA bol skonštruovaný pomocou metódy susedného spájania s použitím modelu GTR nukleotidovej substitúcie, ktorý priniesol najlepší model. Variácia rýchlosti bola zahrnutá do analýzy fylogenézy maximálnej pravdepodobnosti s počtom kategórií rýchlosti substitúcie nastaveným na 4 a parameter distribúcie gama bol nastavený na 1,0. Bootstrap analýza sa uskutočnila so 100 replikátmi, ktoré poskytli výpočtovo uskutočniteľnú konštrukciu fylogenetického stromu.
Predikcia a vizualizácia štruktúry
Monomérne a multimérne štruktúry proteínov vírusu mačacej chrípky boli predpovedané pomocou AlphaFold verzie 2.3.2 pomocou databáz stiahnutých 24. marca 2024. Pre monoméry aj multiméry bol AlphaFold spustený s použitím úplných genetických databáz (–db_preset=full_dbs), so zapnutou relaxáciou na modeli s najlepším skóre (–models_to_relax=best) a vypnutou šablónou (–max_template_date = 1900-01-01). Štruktúry predpovedané AlphaFold boli vizualizované v PyMOL 2.5.4. Príkaz „super“ sa použil na superpozíciu porovnateľných štruktúr z PDB.
Histochémia lektínu
Lektínová histochémia sa uskutočnila na tkanivových rezoch zaliatych v parafíne, ako už bolo opísané [Citácia31 ]. Stručne povedané, rezy s hrúbkou 5 um boli najskôr zbavené parafínu v xyléne a rehydratované pomocou série etanolových úprav. Rehydratované rezy prešli 5-minútovým predbežným namáčaním v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku (TBS), po ktorom nasledovalo získanie antigénu pomocou eBioscience™ IHC Antigen Retrieval Solution – nízke pH (10X) (ThermoFisher Scientific, katalógové č. 00-4955-58), podľa pokynov výrobcu. Rezy boli potom blokované kozím sérom (Thermo Fisher Scientific, katalógové č. PCN5000) zriedeným 1:40 s TBS a ďalej blokované pomocou Streptavidínu/Biotín Blocking Kit (Vector Laboratories, SP2002), podľa pokynov výrobcu. Rezy boli inkubované s lektínom Sambucus Nigra (SNA), značeným fluoresceínom (Vector Laboratories, FL13012), lektínom Maackia Amurensis II (MAA II), nekonjugovaným (Vector Laboratories, L-1260-2) a lektínom Maackia Amurensis (MAA Lectin I I), Fluoresceín (Vector Laboratories, FL13112). SNA sa špecificky viaže na kyselinu sialovú spojenú s galaktózou prostredníctvom alfa-2,6 väzby (SA α-2,6-Gal), zatiaľ čo MAL II a MAL I sa viažu na kyselinu sialovú prostredníctvom alfa-2,3 väzby (SA α- 2,3-Gal), zatiaľ čo MAL I preferuje odlišné glykánové štruktúry v porovnaní s MAL II. Každý lektín bol použitý v koncentrácii 10 ug/ml a inkubovaný cez noc pri 4 °C. Po troch premytiach TBS boli rezy ošetrené streptavidínom, konjugátom Alexa Fluor 594 (Thermo Fisher Scientific, katalógové č. S32356) počas 2 hodín pri 4 °C, aby sa zafarbili lektíny. Po troch premytiach s TBS boli rezy pripevnené pomocou ProLong™ Gold Antifade Mountant s DAPI (Thermo Fisher Scientific, katalógové č. P36931). Po vytvrdzovaní počas 24 hodín pri teplote miestnosti sa rezy zobrazili pomocou Echo Revolve Fluorescent Microscope. Negatívne kontrolné farbenie, uskutočnené vynechaním lektínov, ukázalo minimálne pozadie (doplnkový obrázok 5).
Produkcia pseudovírusu chrípky
Lentivírusové plazmidy 3. generácie získané zo zdrojov BEI (katalógové č. NR-53816) sa použili na produkciu vírusov pseudotypovaných H5 a H1. Sekvencie HA chrípky A H5N1 kladu 2.2 a kladu 2.3.4.4b boli získané z NCBI a expresné konštrukty boli navrhnuté pomocou softvéru SnapGene. Konštrukty boli syntetizované v GenScript, USA a klonované do vektora pHCMV pod kontrolou promótora CMV. H1 expresný plazmid. pHCMV_FLUAV_HA bol dar od Feng Zhang (plazmid Addgene # 207273; http://n2t.net/addgene:207273 ; RRID: Addgene_207273) [Citácia40 ]. Lentivírusové pomocné plazmidy, reportérové plazmidy a plazmidy kódujúce H5 alebo H1 boli kotransfekované do HEK 293 T buniek s použitím transfekčného činidla Fugene6 (Promega, USA, katalógové č. E2691). Pseudovírusy sa zhromaždili 48 hodín po transfekcii a titre sa určili infikovaním HEK-293 T buniek a meraním expresie luciferázy s použitím činidla BrightGlo (Promega, USA, katalógové č. E2650). Relatívne jednotky luminiscencie (RLU) boli merané pomocou BioTek Cytation 7 Cell Imaging Multimode Reader.Na test viazania vírusu sa použilipseudovírusy s titrom infekčnosti medzi 104 a 105 RLU .
Test väzby vírusu
Test väzby vírusu sa uskutočnil s použitím pseudovírusov chrípky A (H5N1 HA, klad 2.2; H5N1 HA, klad 2.3.4.4b; a H1). Rezy tkaniva zbavené parafínu a získaného antigénu sa inkubovali s 250 ul pseudovírusov chrípky A pri 37 °C počas 2 hodín. RLU H5 kladu 2.3.4.4b, H5 kladu 2.2 a H1 pseudovírusov použitých v teste viazania vírusu boli 109 591, 88 124 a 39 879, v tomto poradí. Ďalej boli rezy blokované inaktivovaným kozím sérom (Thermo Fisher Scientific, katalógové č. PCN5000) v riedení 1:40 cez noc. Rezy ošetrené H5N1 boli imunofarbené s použitím primárneho myšacieho monoklonálneho anti-chrípkového vírusu H5 proteín hemaglutinínu (HA) (VN04-8), A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) zo zdrojov BEI (NR-2733), zatiaľ čo tie ošetrené s H1 boli zafarbené protilátkou proti hemaglutinínu proti chrípke A H1N1 [C102 (IV.C102)] (Abcam, katalógové č. ab128412), oba v riedení 1:100 počas 90 minút. Po primárnej protilátkovej inkubácii boli rezy premyté a inkubované so sekundárnou kozou anti-myšou IgG H&L (Alexa Fluor® 647) protilátkou (Abcam, katalógové č. ab150115) pri riedení 1:800 počas 35 minút. Po troch premytiach TBS sa rezy umiestnili do prípravku proti vyblednutiu ProLong Gold s DAPI. Po 24-hodinovom vytvrdzovaní pri teplote miestnosti sa rezy zobrazili pomocou Echo Revolve Fluorescent Microscope. Negatívne kontrolné farbenie, uskutočnené vynechaním vírusu a primárnej protilátky, ukázalo minimálne pozadie (doplnkový obrázok 5). Kontrolné experimenty sa uskutočnili nahradením chrípkového pseudovírusu pseudovírusom SARS-CoV-2, čo nepreukázalo žiadnu krížovú reaktivitu pri farbení (údaje nie sú uvedené).
Imunohistochémia na detekciu nukleoproteínu vírusu chrípky A
Tkanivové rezy boli spracované tak, ako je uvedené v metodológii lektínovej histochémie. Po získaní antigénu boli rezy blokované kozím sérom (Thermo Fisher Scientific, katalógové č. PCN5000) zriedeným 1:40 v TBS. Ďalej sa rezy inkubovali s primárnou nukleoproteínovou protilátkou proti vírusu chrípky A, izotyp: IgG2a (1:100) (Abcam, katalógové č. ab20343) počas 90 minút, potom nasledovala sekundárna kozia anti-myšia IgG H&L (Alexa Fluor® 647) protilátka (Abcam, katalógové č. ab150115) v riedení 1:800 pre 35 min. Po troch premytiach TBS sa rezy umiestnili do prípravku proti vyblednutiu ProLong Gold s DAPI. Po 24-hodinovom vytvrdzovaní pri teplote miestnosti sa rezy zobrazili pomocou Echo Revolve Fluorescent Microscope. Negatívne kontrolné farbenie, uskutočnené vynechaním primárnej protilátky, ukázalo minimálne pozadie (doplnkový obrázok 5). Izotypové kontrolné farbenie sa uskutočnilo s použitím myšieho IgG2a kappa izotypovej kontroly (eBM2a), eBioscience (Thermo Fisher, katalógové č. 14-4724-82), ktorá nevykazovala žiadnu krížovú reakciu a minimálne zafarbenie pozadia (údaje nie sú uvedené).
Kvantifikácia intenzity fluorescencie
Obrázky LHC a IHC sa podrobili kvantifikácii fluorescencie pomocou softvéru ImageJ (v 1,53). Pre každý tkanivový rez sa merala intenzita fluorescencie na piatich rôznych miestach rovnakej veľkosti v rámci obrazu a vypočítala sa priemerná hodnota týchto meraní, aby predstavovala priemernú intenzitu fluorescencie. V prípade črevných tkanív bola oblasť záujmu zameraná na sliznicu, pretože táto oblasť pravdepodobne príde do kontaktu s vírusom pri požití. Tento prístup zabezpečil konzistentnosť kvantifikácie vo všetkých analyzovaných typoch tkanív. Priemerné hodnoty intenzity fluorescencie sa štatisticky analyzovali s použitím jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval post hoc Tukeyov test na určenie významných rozdielov medzi skupinami.
Výsledky
Prepuknutie vírusu H5N1 clade 2.3.4.4b u vonkajších mačiek na vidieku v Južnej Dakote
Vo vidieckej obytnej oblasti v Južnej Dakote (SD) bolo nájdených mŕtvych desať mačiek vo veku od 6 mesiacov do 4 rokov chovaných vonku. Väčšina z týchto mačiek bola domestikovaná a považovaná za rodinných miláčikov. Klinické príznaky zahŕňali anorexiu, letargiu a potenciálne neurologické deficity. Dve mŕtve mačky vo veku šesť a osemnásť mesiacov boli predložené do Veterinárneho diagnostického laboratória Štátnej univerzity v Severnej Dakote (NDSU VDL) na posmrtné vyšetrenia. Spolu s pozitívnymi respiračnými kultúrami Streptococcus canis odhalili výsledky polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) prítomnosť vírusu chrípky A (IAV) v mozgu a pľúcach. Hodnoty prahu cyklu (Ct) pre IAV matricový gén v mozgu boli 20,1 a 18,1 a v pľúcach boli 35,93 a 31,93 pre mačky 1 a 2, čo naznačuje oveľa vyššiu vírusovú záťaž v mozgoch oboch mačiek. Vzorky boli odovzdané do Národného laboratória veterinárnych služieb (NVSL), Ames, Iowa, a ďalej bolo potvrdené, že ide o H5N1 klad 2.3.4.4b pomocou PCR a sekvenovania celého genómu .
Jedinečné mutácie v sekvenciách kladu 2.3.4.4b H5N1 zo smrteľných prípadov mačiek v SD
Fylogenetický strom génu HA z dvoch sekvencií mačacieho H5N1 kladu 2.3.4.4b bol skonštruovaný popri 1443 sekvenciách HA kladu 2.3.4.4b H5N1 od ľudí z celého sveta, kurčiat (Severná Amerika), kačíc, husí a všetkých cicavcov zo Severnej a Južná Amerika. Všetky štatistické testy ukázali, že zahrnutie variácie rýchlosti a topológie do modelu GTR prinieslo najvhodnejší model nukleotidovej substitúcie (doplnkové tabuľky 2–4). Výsledný strom fylogenézy maximálnej pravdepodobnosti ukázal, že HA gén z mačacej sekvencie HPAIV H5N1 kladu 2.3.4.4b v Južnej Dakote boli najbližšie k sekvenciám kladu 2.3.4.4b H5N1 zo vzoriek mliečneho dobytka pochádzajúceho z Južnej Dakoty a Kansasu (, anotovaná zvýraznená oblasť). Pokračovanie TU
Petícia za vyhlásenie referenda
S prosbou. Financujeme sa výlučne prostredníctvom vašich darov. Veľká vďaka
Všetky práva vyhradené © OZ Dôstojnosť Slovenska.
